3．6 PCR诊断技术

    3．6．1普通PCR技术

    HaraswaaR等(1991)报道合成针对猪肺炎支原体的引物，可扩增520 bP的DNA片段，产物以合成的寡核苷酸探针进行印渍杂交鉴定，证明这种方法具有特异性。ArtiushinS等(1993)根据l6sr RNA序列设计PCR引物，通过种特异性寡核苷酸探针进行鉴定，能够扩增出人工感染猪气管分泌液和肺病灶样品中的猪肺炎支原体，并且所建立的PCR方法具有较强的特异性和敏感性。Stemke G W等(1994)建立的PCR可用于猪肺炎支原体的检定与猪鼻肺炎支原体，絮状支原体的鉴别，引物选自16srRNA基因序列，以猪肺炎支原体和絮状支原体DNA扩增，可获得大小为200bp和400bp的产物，而猪鼻支原体未有扩增产物。BlnahcardB等(1996)将PCR的敏感性极限提高到500 fg提纯猪肺炎支原体DNA(约4 X102菌数)，以此检查试验感染猪气管，支气管冲洗液，结果与免疫荧光对照的符合率达到84．6％(121／143)。SornesneV等(1997)将200头SPF猪感染猪肺炎支原体强毒而使其发病，产生临床症状，证明在猪发生肺炎的急性期，PCR方法具有高度敏感性，优于分离培养，免疫荧光检测和ELISA方法。CaronJ等(2000)通过扩增猪肺炎支原体的P36和P46蛋白基因，可以区分猪肺炎支原体和猪鼻支原体感染。在国内，于敏等(2003)根据国内外发表猪肺炎支原体16srRNA基因设计了一对特异性引物，扩增出一个大小为653 bp的特异性片段，敏感性试验显示这对引物能够检测到l ng的DNA，结果表明此方法特异且敏感。Zeehf(2005)改进了一种real—timePCR(rtPCR)方法，从活猪鼻拭子中检测猪肺炎支原体检测了730份不同猪场的鼻拭子，结果显示该方法快速、准确，有l00％特异性。StakenborgT等(2006)发明了一种多重PCR方法可以从临床肺组织中快速鉴别肺炎支原体、猪鼻支原体和絮状支原体。同戈(2007)采用SYBRGREEN荧光定量PCR检测技术对Mhp做到了定性，定量的检测。刘茂军等(2008)据猪肺炎支原体的P36基因序列设计一对引物，建立猪肺炎支原体PCR检测方法，此方法可区别猪鼻支原体、絮状支原体和鸡毒支原体，最低检出量为4．26 ng。

    3．6．2套式PCR技术

    Sternke G W等(1997)发展了套式PCR技术，敏感性提高到可检测出—个MhpDNA，并可以直接特异性地检测出肺中的Mhp。StarkK D等(1998)则利用新的套式PCR首次成功地在试验条件和野外条件下检测出空气样品中的Mhp。CalsmiglaiM等(1999)根据猪肺炎支原体的16srDNA设计了两套种特异性套式PCR引物，研究了一组猪鼻拭子标本中的猪肺炎支原体DNA，发现PCR的检测阳性率为3．6％(2／55)，而套式PCR的检测阳性率为54．5％（30／55)，实验得到了预期的结果，且与存在于猪呼吸道的其他种支原体无交叉反应，说明该检测方法对从鼻拭子中检测猪肺炎支原体优于其他PCR法。VedrniE等(2000赧道，应用套式PCR检测猪气管，支气管灌洗液中的猪肺炎支原体DNA较ELISA和IF法更为灵敏。ViccaJ等(2002)调查了临床感染猪肺炎支原体和亚临床感染猪肺炎支原体的猪群，用套式PCR研究鼻拭子中的猪肺炎支原体，发现第6周时阳性猪在临床和亚临床感染猪群中的百分率分别为l6％和0％。同年，KurthKT等(2002)应用套式PCR检测了一些来自试验感染猪肺炎支原体的猪样品，结果表明来自支气管小泡和气管支气管位点的样品是大多数感染猪肺炎支原体的前兆，而鼻拭子和肺组织位点的样品不是实验引发感染的可靠指标。Otgariiy等(2005)发展的套式PCR通过检测鼻拭子可以用于猪支原体肺炎的监测。

    4 血清学抗体检测技术

    目前用于MPS的血清学试验有放射免疫扩散测定、补体结合试验、间接血凝试验、凝集试验以及酶联免疫吸附试验等，其中以间接血凝试验、补体结合试验和酶联免疫吸附试验更为理想。

    4．1间接血凝试验

    间接血凝试验(IHA)具有一定的特异性和敏感性，是诊断猪支原体肺炎的常用方法之一。Dowdle等首先用IHA检测Mhp抗体，但被感染猪的血清能使绵羊红细胞自然溶血。Lam等用猪红细胞代替绵羊红细胞，虽然其效价比用绵羊红细胞低，但在试验中不易发生溶血现象。由于血清中含有特异吸附因子易溶血，制备的红细胞存在个体差异不易标准化，其试验也不易操作，使得IHA在临床应用中受到了一定的限制。

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