3．2免疫荧光技术

    1970年L·Eluger等首先报道用荧光技术来检测猪肺中的Mhp，1971年Earlier将Mhp接种到兔肉汤后用直接免疫荧光法进行诊断。随后改良的直接和间接荧光抗体技术也被用于检测肺组织中的Mhp。Amanfu等用改良的直接荧光抗体技术连续检测人工感染猪，结果接种后2～12周在患病猪的细支气管和细支气管上皮检测到Mhp，接种后4～6周荧光最强，8～12周荧光强度逐渐下降。而将间接免疫荧光技术用于冰冻切片的检测，已在丹麦SPF猪群中得到了应用。荧光抗体技术特别适合于Mhp急性期感染，因为这时在肺部存在大量的病原。但当猪在受到抗生素治疗后或转为慢性感染时，血清阳性猪由于支原体的数量不足，用免疫荧光技术检测而易出现假阴性结果。

    3．3免疫酶技术

    酶联免疫过氧化物和间接免疫过氧化物酶试验用于检测病肺中的Mhp，克服了荧光抗体技术不能有效检测慢性感染猪、需要新鲜冰冻组织和荧光显微镜以及样品不能长期保存的缺点。用ELIP检查肺冰冻切片和支气管的涂片时，支原体被染成淡红褐色的多形态颗粒，反应很稳定。Doster等用福尔马林固定石蜡包埋猪肺，用间接过氧化物酶试验检测Mhp，用光学显微镜就能观察到结构清晰的Mhp，而且样品可长期保存，用于重新评价，比荧光抗体法更敏感。当没有鲜组织或其他特异性试验时可采用此法。

    3．4免疫印迹法

    免疫印迹(immtmoblot)是以免疫覆盖液为检测探针，对抗原或抗体进行印迹分析的通称。蛋白质印迹中由于引进了血清学检测技术，使结果的分析更加准确、细致。StPkiovstiL(1991)在蛋白质印迹试验中用抗猪肺炎支原体P36蛋白的兔血清检测了13株不同地方的猪肺炎支原体和来自不同实验室的3株标准菌株J，实验结果显示每株菌在36KDa蛋白处有很强的反应。用同样的抗血清，而抗原用47种来自人、老鼠、兔子、家禽、反刍动物、狗和猫的支原体属作蛋白质，实验结果显示这些微生物与P36抗血清无反应。

    3．5核酸探针诊断技术

    核酸探针技术可解决猪肺炎支原体培养和鉴定难、费时的难题。Stemke将MhpDNA的EcoR l酶切片段随机克隆到Ml3mpl9中，用重组产物作探针来检测Mhp。此方法敏感性高，但特异性不强，易与同源性高的絮状支原体产生交叉反应。Ahrens等将Mhp基因文库中的一个l．3 kb的DNA片段用35S标记作为探针通过点杂交检测猪、牛的不同支原体，结果探针仅对Mhp有特异性反应。Futo等建立了用与MhprRNA互补的寡聚脱氧核苷酸作DNA探针，用印标记后检测支气管肺泡洗出液和病肺组织等临诊样品的方法，其特异性和敏感性都大大提高，比用放射同位素测定的灵敏度高10倍。Johansson等设计出与Mhpl6S rRNA可变区互补的特异性寡聚核苷酸探针，用斑点杂交检测来自感染猪的肺活组织或肺其他感染物。Kwon等用PCR扩增的520 bp的重复DNA序列作为DNA探针，用地高辛标记探针通过组织原位杂交法检测自然感染了Mhp的病原DNA，这种原位杂交技术能有效检测出来自自然感染猪组织中的Mhp核酸以及病原核酸分布情况。李桂兰(2007)采用地高辛标记的探针对可疑病料组织进行斑点杂交，显示此方法特异性强，灵敏性高。肖国生等(2008)采用在猪肺炎支原体的16S rRNA、P36和P463个基因内设计3个靶基因片段，用PCR标记Cy3探针，建立了用于检测和鉴定猪肺炎支原体的检测芯片方法，该检测芯片能快速检测临床样品混合培养物中的猪肺炎支原体，还能鉴定可疑分离株是猪肺炎支原体还是其它支原体。

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